Quantificação Molecular do Parasita Leishmania por PCR Real Time
O que é a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)?
A técnica PCR baseia-se na amplificação in vitro de regiões específicas de DNA (fragmento alvo ou molde), visando atingir uma quantidade suficiente de material genético para análise molecular.
O que é a PCR Real Time?
A técnica PCR Real Time é uma categoria de PCR que permite a detecção e quantificação em tempo real de uma região específica do material genético. Para que isso ocorra, são empregadas sondas específicas para o fragmento alvo, marcadas com fluoróforos. Durante a amplificação do DNA, essas sondas se ligam ao fragmento alvo e são inativadas enzimaticamente. Ao serem inativadas, ocorre emissão de fluorescência, que é proporcional a um determinado produto da PCR. A detecção de fluorescência indica a presença ou ausência das regiões pesquisadas, de forma rápida, precisa e sensível.
Vantagens da Técnica PCR Real Time na detecção das Leishmanioses
– Monitoramento da carga parasitária: quantificação da expressão gênica em diferentes amostras biológicas.
– Detecção rápida da Leishmania: graças à amplificação e à detecção simultâneas dos produtos a cada ciclo realizado, a PCR Real Time representa uma significativa redução de tempo na realização nos testes moleculares.
– Especificidade: no PCR Real Time para Leishmania, é utilizado material genético específico desse parasita, garantindo que apenas material genético de Leishmania seja alvo da reação.
– Sensibilidade: a seleção da sequência alvo determina a sensibilidade e a especificidade do teste. Uma maior sensibilidade é atingida quando sequências de DNA presentes em cópias múltiplas são utilizadas, como, por exemplo, a região conservada dos minicírculos de DNA do Cinetoplasto (kDNA). O kDNA apresenta cerca de 10.000 minicírculos de DNA distribuídos em uma região conservada e uma região variável. Iniciadores específicos para amplificar esta região conservada são úteis na detecção de todas as espécies de Leishmania, enquanto aqueles direcionados para a região variável permitem a diferenciação de cada espécie ou complexo de espécies existentes. Tais particularidades fornecem maior eficiência à reação e, consequentemente, ao diagnóstico e monitoramento durante a terapêutica da leishmaniose.
Quando solicitar testes moleculares por PCR Real Time na detecção das leishmanioses?
A abordagem quantitativa pode ser útil no monitoramento da carga parasitária em tecidos caninos em fase de tratamento e pós tratamento.
Assim, é possível identificar recidivas da leishmaniose, acompanhar a evolução da patologia e avaliar a eficiência de um tratamento farmacológico. Consequentemente, o teste fornece informações para a otimização do tratamento e quanto ao prognóstico da infecção.
Reações falso-positivas e falso-negativas
Reações falso-negativas podem ocorrer quando a quantidade de parasitas na amostra estiver abaixo da capacidade de detecção do teste. Por sua vez, resultados falso-positivos podem ocorrer em casos de contaminação da amostra.
Material para envio: na leishmaniose visceral, a carga parasitária varia em um mesmo tecido com o tempo após a infecção e também entre tecidos diferentes em um mesmo momento. Logo, a própria variabilidade da infecção, em questão de amostras selecionadas, pode influenciar no resultado encontrado.
Tipos de material para envio:
-Aspirado de medula óssea em EDTA: é indispensável o uso de EDTA, na proporção 1: 5 (1 parte de EDTA: 5 partes de sangue).
– Aspirado de linfonodos: diluir as amostras sempre em 200 microlitros de soro fisiológico estéril.
Observações:
– Todas as amostras devem ser coletadas em frasco estéril.
– Enviar as amostras refrigeradas em até 24 horas. A confiabilidade, especificidade e sensibilidade do teste dependem do cumprimento de todas estas recomendações.
