PCR – Real Time: Diagnóstico quantitativo para leishmaniose visceral canina

Atualmente estão disponíveis diversas metodologias para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC). O diagnóstico laboratorial pode ser feito através do exame parasitológico direto, por meio de métodos imunológicos: a imunofluorescência indireta (RIFI) ou ensaios imunoenzimáticos (ELISA), por método de imunohistoquímica e, mais recentemente, através de métodos moleculares de amplificação do ácido nucléico (PCR e PCR-Real Time). Cada metodologia tem particularidades que devem ser conhecidas pelo clínico no momento da requisição e da interpretação do exame.

PCR – Reação em Cadeia de Polimerase

Vários estudos demonstram que a PCR é altamente específica e mais sensível do que os métodos microbiológicos clássicos utilizados para o diagnóstico da LVC. A utilização da PCR permite a detecção do parasita com uso de sondas específicas de forma não invasiva, através da amplificação do cinetoplasto da Leishmania sp.

A PCR pode ser utilizada em qualquer amostra biológica, incluindo pele, sangue, biópsia de linfonodo e medula óssea.

Reações falso-negativas podem ocorrer quando a quantidade de DNA está abaixo da sensibilidade de detecção do teste.

PCR- REAL TIME

A técnica PCR Real Time é uma categoria de PCR que permite a detecção e quantificação em tempo real de uma região específica do material genético. Para que isso ocorra, são empregadas sondas específicas para o fragmento alvo, marcadas com fluoróforos. Durante a amplificação do DNA, essas sondas se ligam ao fragmento alvo e são inativadas enzimaticamente. Ao serem inativadas, ocorre emissão de fluorescência, que é proporcional a um determinado produto da PCR. A detecção de fluorescência indica a presença ou ausência das regiões pesquisadas, de forma rápida, precisa e sensível.

Dúvidas mais freqüentes

Quais as vantagens da Técnica PCR Real Time na detecção das Leishmanioses?

– Monitoramento da carga parasitária: quantificação da expressão gênica em diferentes amostras biológicas.

– Detecção rápida da Leishmania: graças à amplificação e à detecção simultâneas dos produtos a cada ciclo realizado, a PCR Real Time representa uma significativa redução de tempo na realização nos testes moleculares.

– Especificidade: no PCR Real Time para Leishmania, é utilizado material genético específico desse parasita, garantindo que apenas material genético de Leishmania seja alvo da reação.

– Sensibilidade: a seleção da seqüência alvo determina a sensibilidade e a especificidade do teste. Uma maior sensibilidade é atingida quando sequências de DNA presentes em cópias múltiplas são utilizadas, como, por exemplo, a região conservada dos minicírculos de DNA do Cinetoplasto (kDNA). O kDNA apresenta cerca de 10.000 minicírculos de DNA distribuídos em uma região conservada e uma região variável. Iniciadores específicos para amplificar esta região conservada são úteis na detecção de todas as espécies de Leishmania, enquanto aqueles direcionados para a região variável permitem a diferenciação de cada espécie ou complexo de espécies existentes. Tais particularidades fornecem maior eficiência à reação e, conseqüentemente, ao diagnóstico e monitoramento durante a terapêutica da leishmaniose.

Quando solicitar testes moleculares por PCR Real Time na detecção das leishmanioses?

A abordagem quantitativa pode ser útil no monitoramento da carga parasitária em tecidos caninos em fase de tratamento e pós-tratamento. Assim, é possível identificar recidivas da leishmaniose, acompanhar a evolução da patologia e avaliar a eficiência de um tratamento farmacológico. Conseqüentemente, o teste fornece informações para a otimização do tratamento e quanto ao prognóstico da infecção.

O Santé Laboratório realiza todos os testes para um diagnóstico completo juntamente com a avaliação do Clínico Veterinário.

Observações:

– Todas as amostras devem ser coletadas em frasco estéril.

– Enviar as amostras refrigeradas em até 24 horas.

A confiabilidade, especificidade e sensibilidade do teste dependem do cumprimento de todas estas recomendações.

“Acreditamos que a união entre os agentes envolvidos com a LVC, quais sejam, os médicos veterinários clínicos, os de saúde pública e a comunidade de proprietários de cães devem estar imbuídos de um espírito de mútua colaboração e responsabilidade. Muitas pesquisas estão por vir, sedimentando os conceitos até aqui produzidos ou modificando condutas. A ciência é feita sem radicalismos ou afirmações movidas por emoções, mas deve fundamentar-se sobretudo no respeito a vida.”     Ribeiro, V.M.

* Gláucia Mansur Balsamão, M.V., Mestre em Medicina Veterinária Preventiva, MBA GNeg, Membro Red FAO Salud Publica Veterinaria y Zoonosis para America Latina y el Caribe.