Métodos diagnósticos para Leishmania Visceral Canina

INTRODUÇÃO 

As leishmanioses säo zoonoses causadas por diversas espécies de protozoários do gênero Leishmania (Ross,1903). A leishmaniose visceral é uma doença crônica grave que afeta ao homem e aos animais, com prognóstico reservado e na maioria dos casos fatal.  É causada por espécies do gênero Leishmania pertencem à família Trypanosomatidae. Animais silvestres e domésticos são os reservatórios mais comuns do parasita, que tem como vetores, insetos dípteros, da família Phlebotominae seu ciclo biológico realizado em dois hospedeiros, um vertebrado e outro invertebrado, apresentando morfologias típicas para cada um. No vertebrado infectado, Leishmania é encontrada sob a forma amastigota no interior de células do sistema retículo endotelial. No trato alimentar do inseto vetor hospedeiro invertebrado, é encontradas as formas extracelulares paramastigotas e promastigotas. As formas amastigotas e promastigotas podem ser cultivadas in vitro. A ocorrência da doença em uma determinada área depende basicamente da presença do vetor susceptível e de um hospedeiro /reservatório igualmente susceptível. As leishmanioses encontram-se amplamente distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do Velho e do Novo Mundo, atingindo 88 países dos continentes americano, europeu, asiático e africano (WHO, 2001).

No gênero Leishmania estão incluídas mais de 30 espécies, das quais, ao menos, 20 são agentes causais de leishmaniose. Nos seres humanos as leishmanioses caracterizam-se por manifestações clínicas que podem variar desde lesões cutâneas ou mucocutâneas, até a forma visceral, na dependência da interação do complexo imunológico do hospedeiro e da espécie envolvida (Gallego,2004).

Na América Latina, a doença foi descrita em 12 países a maioria do os casos ocorre no Brasil.  Do primeiro caso no Brasil ocorreu em 1913, (Alencar et al. 1991).

Desde então, a transmissão da doença vem sendo descrita em vários municípios, de todas as regiões do Brasil, exceto na Região Sul. A doença tem apresentado mudanças importantes no padrão de transmissão, inicialmente predominados pelas características de ambientes rurais e periurbanas e, mais recentemente, em centros urbanos como Rio de Janeiro (RJ), Corumbá (MS), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Palmas (TO), Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS), entre outros. Atualmente, no Brasil a LV está registrada em 19 das 27 Unidades da Federação, com aproximadamente 1.600 municípios apresentando transmissão autóctone. A mudança do perfil epidemiológico da leishmaniose para áreas urbanas torna-se visível principalmente nas grandes periferias onde o adensamento populacional humano e canino é alto, o processo da verticalização das cidades é constante e o estado imunológico da população é alterado portadores como estresse, desnutrição, drogas, enfermidades transmissíveis, entre elas, o HIV.O controle da doença, proposto pelo Ministério da Saúde.As ações do Programa de Controle da Leishmaniose Visceral no Brasil,são as mesmas iniciadas na década de 1940, que visam os três elementos da cadeia de transmissão: o vetor, o reservatório principal (o cão doméstico) e o homem doente (Ministério da Saúde, 1996; Costa e Vieira, 2001, Manual… 2003). No Brasil, a leishmaniose visceral canina (LV canina) coexiste com a LV humana em todos os focos conhecidos e sempre precede a ocorrência de casos humanos. O cão tem papel fundamental como reservatório do parasita e na introdução da LVA em novas áreas (Manual.. 2003).

Diferentes técnicas podem ser utilizadas para o diagnóstico de leishmaniose visceral humana e canina. Muitos avanços têm ocorrido nos últimos anos, mas a despeito do grande número de testes disponíveis para o diagnóstico da LV, nenhum apresenta 100% de sensibilidade e especificidade.

O objetivo deste trabalho foi uma revisião bibliográfica de das diferentes técnicas utilizadas para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

De acordo com o MINISTÉRIO DA SAÚDE de Secretaria de Vigilância em Saúde de Brasil (Ministério da Saúde, 1996,2000 e 2003). O diagnóstico parasitológico é o método de certeza e se baseia na demonstração do parasito obtido de material biológico de punções hepática, linfonodos, esplênica, de medula óssea e biópsia ou escarificação de pele. Entretanto, alguns desses procedimentos, embora ofereçam a vantagem da simplicidade, são métodos invasivos, significando a ocorrência de riscos para o animal e também impraticáveis em programas de saúde pública, em que um grande número de animais deva ser avaliado em curto espaço de tempo. É um método seguro de diagnóstico, uma vez que o resultado positivo é dado pela observação direta de formas amastigotas. A especificidade do método é de aproximadamente 100%,e a sensibilidade depende do grau de parasitemia, tipo de material biológico coletado ,tempo de leitura da lâmina, estando em torno de 80% para cães sintomáticos e menor ainda para cães assintomáticos.

O diagnóstico parasitológico na demonstração do parasito obtido de material biológico de punções hepática, linfonodos, esplênica, de medula óssea e biópsia ou escarificação de pele, a sensibilidade do exame direto pode ser baixa, variando de 52% a 98%. A detecção de parasitas pelo exame microscópico é dependente da presença de um grande número de parasitas na amostra. Os parasitas podem ser cultivados do material aspirado para aumentar a sensibilidade, mas isso pode atrasar o tratamento por semanas (Disch et al.,2006).

Este manual também recomenda realização de provas sorológicas como a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático (ELISA), fixação do complemento e aglutinação direta. Atualmente, para inquéritos em saúde pública os exames disponíveis para diagnóstico sorológico são a RIFI e o ELISA, que expressam os níveis de anticorpos circulantes. O material recomendado é o soro sangüíneo. A RIFI tem sido amplamente utilizada para o diagnóstico de várias doenças parasitárias, podendo apresentar reações cruzadas principalmente com a leishmaniose tegumentar americana (LTA) e a doença de Chagas. O resultado considerado soro reagente é aquele que possua título igual ou superior ao ponto de corte que é a diluição de 1:40.O ELISA consiste na reação de anticorpos presentes nos soros com antígenos solúveis e purificados de Leishmania obtidos a partir de cultura in vitro (Ministério da Saúde, 2005,2006). A pesquisa de anticorpos marcados com enzimas e útil para o diagnóstico de várias doenças. No entanto, muitas vezes existem dificuldades em relação à obtenção desses reagentes específicos para a espécie animal a ser estudada, seja pelo custo ou pela indisponibilidade no mercado (Lonardonier et al.. 2006).

Estudos realizados em ano 2006 por Ferreira em Belo Horizonte para o diagnóstico da leishmaniose donde avaliou o desempenho de três métodos sorológicos diferentes RIFI, ELISA e DAT em 234 amostras de soros de cães de área endêmica. A RIFI apresentou baixa sensibilidade (72%), especificidade (52%), e reação cruzada com soros de cães infectados com T. cruzi, L. braziliensis e E. canis. O teste de ELISA apresentou elevada sensibilidade (95%) embora com especificidade baixa (64%), e reação cruzada com soros de cães infectados com T. cruzi, L. braziliensis e E. canis. ODAT apresentou elevadas sensibilidades (93%), especificidade (96%), e reação cruzada apenas com uma amostra de E. canis. Testes sorológicos são bem sucedidos na detecção da leishmaniose visceral, mas a baixa resposta humoral característica dos indivíduos assintomáticos freqüentemente coloca seus níveis de anticorpos abaixo da linha de corte (cut-off) ou no seu limite de detecção.Um resultado positivo em técnicas imunológicas não necessariamente representa uma infecção ativa e pode apenas indicar uma exposição prévia ou um contato com Leishmania, o que é particularmente comum em áreas endêmicas. Assim como, um resultado negativo não descarta a infecção, principalmente nas formas ocultas (Riera et al,2003).

Lonardonier et al.. 2006 estudaram 92 cães errantes com o objetivo de comparar a imunofluorescência indireta (IFI) e a aglutinação direta (AD) na investigação da leishmaniose tegumentar americana (LTA) canina, no período de outubro de 1999 a novembro de 2001. Os animais foram examinados quanto à presença de lesões e submetidos à intradermorreação de Montenegro (IDRM) e à pesquisa de anticorpos anti-Leishmania por IFI e AD. A IFI apresentou sensibilidade de 78,9% e especificidade de 93,8% (título =40), e a AD sensibilidade de 57,9% e especificidade de 68,8% (título =80). Dois cães apresentavam lesão, mas a pesquisa do parasito foi negativa. A IDRM, realizada em 89 cães, foi positiva em três (3,4%). Trinta e quatro cães (37,0%) foram positivos para a IFI, 61 (66,3%) para a AD e 69 (75,0%) para a IFI e/ou a AD. Neste trabalho, observou-se que a especificida de da AD foi inferior à encontrada na IFI. No entanto, a AD pode ser utilizada na triagem sorológica de cães ou na investigação de outros animais para os quais não há conjugados disponível.

Estudos realizados por Wagner 2007 em 162 amostras clínicas coletadas de cães suspeitos de leishmaniose.A comparação dos resultados obtidos pela sorologia e pela técnica de PCR mostrou 87% de concordância, com 141 dos 162 casos produzindo resultados idênticos tanto pela PCR quanto pela sorologia. A concordância entre os resultados positivos e negativos produzidos por cada método foi de 88,7% (110/124) e 52,8% (19/36), respectivamente. Estes resultados indicam alta discrepância entre a PCR e a sorologia para os casos negativos. Isso pode acontecer devido a alguns fatores, como a permanência de anticorpos circulantes no sangue periférico mesmo após a eliminação do agente.

Entre as técnicas sorológicas, a reação de imunofluorescência (RIF) (Duxbury and Sadun, 1964), o “enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA) (Ho et al., 1983), e o teste de aglutinação direta (El-Harith et al., 1986) são as mais utilizadas. Esses testes usam promastigotas ou proteínas solúveis do parasita como fonte de antígeno, o que pode limitar a especificidade do teste e/ou aumentar os problemas com a produção de preparações antigênicas padrões. A sorologia mostra que os animais infectados desenvolvem uma resposta especifica de anticorpos, e a proporção de soro conversão entre animais com infecção clínica ou subclínica é desconhecida. Em relação a sorologia, animais saudáveis podem ser soropositivos, e animais infectados ocasionalmente se tornam soronegativos, dificultando o uso destas técnicas.

Recentemente, vários estúdios têm mostrado que a reação em cadeia pela polimerase (PCR) é um método sensível e específico para a detecção do DNA da Leishmania em uma variedade de amostras de humanos, cães e raposas. Também há alguns anos, vários autores já demonstraram que a PCR pode melhorar a detecção de leishmaniose visceral canina (Ashford et al., 1995;1998, Berrahal et al., 1996; Sanches et al., 2001).PCR para Leishmania a fim de amplificar um número diferente de alvos de DNA usando sangue periférico como amostra clínica mostrou ser uma alternativa não invasiva altamente eficiente para o diagnóstico da infecção, mostrando sensibilidades de 82% a 100% e especificidade de 100% (Singh et al., 1999; Lachaud et al., 2000; Xiao-Su et al., 2000; Fisa et al., 2002).

Entretanto, enquanto o diagnóstico da leishmaniose visceral em humanos pode ser considerada extremamente eficiente (Costa et al., 1999; Lachaud et al., 2000; Mathis and Deplazes, 1995), o diagnóstico por PCR da leishmaniose visceral canina continua a ser um problema sério, devido, por exemplo, as dificuldades encontradas na preparação do DNA ou a alta freqüência de inibidores de PCR em sangue de cães. Além disso, amostras de sangue permitem o exame uma maior quantidade de volume de amostra do que amostras de medula óssea, que é sempre sugerido como tipo ideal de material clínico para a detecção de DNA de Leishmania por PCR (Lachaud et al., 2002 Nuzum et al., 1995).

De acordo com (Bisugo, 2007) O diagnóstico da LV canina representa em si, um grande desafio, pois não existe um único método que seja simples, de baixo custo, reprodutível, sensível e específico para diagnosticar os vários estágios da doença. Tampouco é possível apontar-se para um método classificado como “padrão ouro” para a LV (OIE). Entretanto, diferentes técnicas podem exercer a função de teste de referência de acordo com o tipo de investigação, como por exemplo a identificação de cães de áreas endêmicas ou suspeitas de transmissão autóctone, monitoramento de estágios da infecção, entre outros.Em virtude da inexistência ou implementação de outras medidas que impeçam a infecção do vetor ou dos hospedeiros vertebrados, a realização de inquéritos caninos e eutanásia de cães soropositivos, até o momento, é a única estratégia de controle disponível direcionada à população canina e adotada para execução em larga escala pelo Ministério da Saúde; embora limitada quanto à operacionalização e resultados efetivos.

Segundo Costa e Vieira, 2001, Camargo-Neves e Gomes, 2002,2004, .citado por (Bisugo, 2007) a eliminação dos cães adotada pelo Programa de Controle de LVA no Brasil é considerada a medida de controle de menor suporte técnico-científico. A baixa eficiência dos testes sorológicos em detectar unicamente a infecção canina por L. (L.) chagasi; a ausência de padronizações em relação aos procedimentos para a realização desses testes, como a coleta das amostras, identificação dos animais, tipo de amostra examinada (eluato ou soro sangüíneo), reagentes, antígenos, conjugados, etc.;a ocorrência de falsos resultados positivos em situações de erliquiose, babesiose, LTA e doença de Chagas e a inexistência de um programa de controle de qualidade do diagnóstico laboratorial da LV canina dificultam a operacionalização dessa estratégia de controle.A falta de um teste diagnóstico mais sensível e específico, o impacto ambiental do controle químico e a má aceitação da eliminação dos cães pela população, dificultam a implementação e a avaliação das medidas de controle da doença

CONCLUSÕES

• O ensaio padrão de PCR é uma ferramenta confiável para a detecção de DNA de Leishmania y e diagnostico espécie -especifico de material clínico.  Quando a PCR da um resultado positivo, não é preciso repetir e podemos afirmarcom certeza que o cão pesquisado tem o parasita (Leishmania) no sangue, pois não existe o falso-positivo, uma vez que os oligonucleotídeos são específicos para a Leishmania.
• Os resultados discrepantes em el diagnostico podem ser devido a vários fatores: a permanência de anticorpos circulantes no sangue periférico mesmo após a eliminação do parasita; a baixa quantidade de parasita circulante no sangue no momento da coleta e consequentemente não detectado pela PCR e microscopia, imunodeficiência de alguns pacientes a reações cruzadas da sorologia com outras doenças (doença de Chagas,bactérias, alguns tipos de vírus, etc…).
• Resultado negativo deve ser repetido, de preferência em uma segunda extração da mesma amostra (extração feita em duplicata ou triplicata). De qualquer forma,um resultado negativo pode significar que o cão não tem o parasita, mas isso não poderá ser afirmado com certeza, devido aos fatores falados anteriormente.

• E baixo valor preditivo positivo e negativo da sorologia, normalmente atribuído a anticorpos persistentes ou imunossupressão, respectivamente.

Foram realizados 8.436 exames de Leishmaniose no santé Laboratório pelas técnicas de ELISA e RIFI. Destes exames realizados, aproximadamente 30% (29,4%) apresentaram divergência entre os testes.

Foram realizados 981 exames de Leishmaniose no santé laboratório pela técnica de PCR, em testes positivos no ELISA e RIFI e em testes com ELISA negativo e RIFI positivo, ou ELISA negativo e RIFI positivo. Destes, apenas 60% (58,73%) apresentaram resultados positivo.

As amostras enviadas foram de sangue periférico, linfonodos e medula óssea (material de eleição), entretanto a técnica não apresentou sensibilidade suficiente para confirmar todos os casos suspeitos positivos.

Foram realizados 296 testes parasitológicos para detecção de Leishmaniose através de punção de medula óssea. Neste teste, apenas 6,4% apresentou resultado positivo em animais com testes positivos no ELISA e RIFI e em testes com ELISA negativo e RIFI positivo, ou ELISA negativo e RIFI positivo.

A bibliografia confirmou que ainda não existe uma técnica de diagnóstico com 100% de especificidade e sensibilidade e que a escolha da técnica dependerá do objetivo do estudo.

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